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當(dāng)前位置：南京沃博生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>可直接在痰液中檢測(cè)肺結(jié)核的CRISPR技術(shù)
結(jié)核分枝桿菌是全球健康的主要威脅，而目前的結(jié)核病診斷方法存在諸多局限?；谂囵B(yǎng)的方法雖然靈敏度高，但耗時(shí)長(zhǎng)；鏡檢速度較快，約1小時(shí)就能完成，卻依賴專業(yè)操作人員，且靈敏度和特異性有限；PCR技術(shù)十分靈敏，不過(guò)仍需要熱循環(huán)設(shè)備。
針對(duì)這些問(wèn)題，普林斯頓大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了可在資源匱乏地區(qū)使用的便攜式結(jié)核病檢測(cè)平臺(tái)SHINE-TB。該系統(tǒng)結(jié)合了等溫?cái)U(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas13a/Cas12a體系，能夠?qū)Y(jié)核桿菌的IS6110和IS1081序列進(jìn)行高靈敏檢測(cè)，同時(shí)引入人源內(nèi)參ERVK用于樣本質(zhì)量監(jiān)控，具備一鍋反應(yīng)、凍干保存和側(cè)流檢測(cè)等特點(diǎn)。
其檢測(cè)原理為：首先采用相對(duì)低成本、簡(jiǎn)便的Chelex方法提取痰液中的核酸，這個(gè)過(guò)程需要簡(jiǎn)單的離心機(jī)和95攝氏度加熱30分鐘；粗提后，目標(biāo)Mtb DNA經(jīng)RPA等溫?cái)U(kuò)增，再通過(guò)Cas13a識(shí)別體外轉(zhuǎn)錄的RNA靶標(biāo)并釋放熒光或側(cè)流信號(hào)；同時(shí)，Cas12a檢測(cè)人類ERVK序列作為內(nèi)參，確保樣本充分性與反應(yīng)有效性。整個(gè)體系可凍干保存并現(xiàn)場(chǎng)重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)一管反應(yīng)、一體化操作。
圖1.檢測(cè)原理及優(yōu)化Cas12a檢測(cè)Mtb
測(cè)試結(jié)果顯示，SHINE-TB系統(tǒng)在痰液樣本中對(duì)H37Rv和BCG菌株的檢測(cè)限分別為69.0和80.5 CFU/mL，靈敏度與商業(yè)Xpert Ultra相當(dāng)或更優(yōu)。在14例臨床樣本中，該系統(tǒng)達(dá)成了100%的靈敏度和100%的特異度，且兼容凍干與側(cè)流讀數(shù)。
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Cas酶系列：
貨號(hào) | 包裝規(guī)格 | 中文名稱 |
32108-01 | 100 pmoL | LbCas12a (Cpf1) |
32108-03 | 1,000 pmoL | LbCas12a (Cpf1) |
32117-01 | 100 pmoL | LwaCas13a (C2c2) |
32117-03 | 1,000 pmoL | LwaCas13a (C2c2) |
32118-01 | 100 pmoL | AapCas12b (C2c1) |
32118-03 | 1,000 pmoL | AapCas12b (C2c1) |
32119-01 | 100 pmoL | Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
32119-03 | 1,000 pmoL | Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
32104-01 | 100 pmoL | AsCas12a (Cpf1) |
32104-03 | 1,000 pmoL | AsCas12a (Cpf1) |
32116-01 | 100 pmoL | AacCas12b (C2c1) |
32116-03 | 1,000 pmoL | AacCas12b (C2c1) |
32106-01 | 100 pmoL | FnCas12a (Cpf1) |
32106-03 | 1,000 pmoL | FnCas12a (Cpf1) |
32110-01 | 100 pmoL | Lb5Cas12a (Cpf1) |
32110-03 | 1,000 pmoL | Lb5Cas12a (Cpf1) |
32101-01 | 100 pmoL | SpCas9 |
32101-03 | 1,000 pmoL | SpCas9 |
32102-01 | 100 pmoL | Sp-dCas9 |
32102-03 | 1,000 pmoL | Sp-dCas9 |
32120-01 | 100 pmoL | Sp-nCas9（H840A） |
32120-03 | 1,000 pmoL | Sp-nCas9（H840A） |
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