端粒酶作為腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展

【資料簡介】

摘要 zui近大量的研究表明細(xì)胞端粒酶激活是多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生的先決條件。端粒酶在惡性腫瘤組織及相關(guān)脫落細(xì)胞中檢出率很高，因此可作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物。
　　關(guān)鍵詞：腫瘤；標(biāo)志物；端粒酶
　　長期以來，普遍認(rèn)為癌癥是由破壞細(xì)胞正常生長調(diào)節(jié)的多種基因突變引起。盡管不同的癌癥可能涉及到一個特定的基因突變，個體的癌癥往往表現(xiàn)為以多基因突變?yōu)樘卣?。除了這種特殊的病因?qū)W外，zui近的研究支持一種新的模式，即端粒酶的激活可能是許多惡性腫瘤發(fā)生的先決條件^[1]。

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　　1 端粒、端粒酶與細(xì)胞永生
　　端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其DNA的特殊是含有大量的（TTAGGG）n串聯(lián)重復(fù)并富含G的重復(fù)序列，這些序列在進(jìn)化中高度保守。端粒結(jié)構(gòu)功能主要有2個：一是可保護(hù)染色體基因組免受被降解或有害重組，其二是端粒重復(fù)可為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列以暫時緩沖或取消末端復(fù)制問題所帶來的染色體DNA進(jìn)行性縮短。大多數(shù)普通體細(xì)胞的端粒會隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，zui終達(dá)到一個使染色體完整性喪失的臨界點(diǎn)，細(xì)胞增殖停止。說明端粒的縮短與高等真核生物中正常體細(xì)胞增生受到限制相關(guān)，在細(xì)胞衰老中扮演“分裂鐘”的作用^[1]。
　　與體細(xì)胞不同，生殖細(xì)胞要為將來產(chǎn)生新的有機(jī)體而保存基因組的全部信息。為此它們必須解決端?？s短所引起的不良后果，方法是在染色體末端補(bǔ)充新的端粒重復(fù)序列。端粒酶就是行使這種功能的DNA聚合酶，它是由RNA、蛋白質(zhì)構(gòu)成的核酸蛋白，可在體內(nèi)以酶結(jié)構(gòu)中的RNA成份（與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)）為模板，在染色體末端催化添加TTAGGG重復(fù)序列。在生殖細(xì)胞中由于有端粒酶表達(dá)，其端粒不隨年齡增長而縮短，故生殖細(xì)胞為永生細(xì)胞^[1]。
　　由于端粒縮短和端粒酶無活性，體細(xì)胞通常逐漸衰老死亡。僅有極少數(shù)細(xì)胞偶然通過激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延長可能給另外的基因損傷的積累提供機(jī)會，導(dǎo)致進(jìn)行性腫瘤性發(fā)展^[2]。在大多數(shù)癌細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞中端粒酶均有高水平表達(dá)^[3]。表明端粒酶的激活表達(dá)與細(xì)胞的無限增殖有密切關(guān)系，通過解除細(xì)胞衰老過程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是體細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。
　　2 正常組織器官端粒酶表達(dá)
　　一些正常需要更新的組織表達(dá)低水平的端粒酶，其作用僅是部分補(bǔ)償末端復(fù)制問題造成的端粒進(jìn)行性縮短^[1]。已發(fā)現(xiàn)有端粒酶表達(dá)的正常組織有外周血淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、胚胎體細(xì)胞、毛發(fā)、皮膚、子宮內(nèi)膜等分裂旺盛的組織。正常外周血單個核細(xì)胞表達(dá)端粒酶的水平僅為無限增殖的癌細(xì)胞的1%～2%^[4]。Hiyama等^[5]發(fā)現(xiàn)正常的腸道粘膜有端粒酶活性，他認(rèn)為這種酶表達(dá)起源于腸道基底干細(xì)胞，但其水平比癌性粘膜低10倍～100倍。盡管造血祖細(xì)胞和激活的淋巴細(xì)胞表達(dá)很強(qiáng)的端粒酶活性，但端粒仍然逐漸縮短，提示在這些細(xì)胞是以一種與端粒長度無關(guān)的方式上調(diào)酶活性^[6]。
　　由于組織樣品通常是不同類型細(xì)胞的混合物，其中可能含有表達(dá)端粒酶的正常細(xì)胞，如果不了解由正常細(xì)胞產(chǎn)生的背景表達(dá)水平，就有可能將正常細(xì)胞的表達(dá)誤判為腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。
　　3 端粒酶作為腫瘤標(biāo)志物早期診斷腫瘤
　　研究表明，大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞均有較高水平的端粒酶表達(dá)。而且在一些前侵襲性病變（如發(fā)育異常、原位癌）端粒酶表達(dá)的頻率很高^[2，3]，表明端粒酶激活是癌癥多步驟形成過程中的早期事件。常見惡性腫瘤端粒酶表達(dá)情形見附表。癌組織端粒酶表達(dá)有以下特點(diǎn)。
　　3.1 癌組織表達(dá)陽性率很高，除少數(shù)腫瘤外，陽性率均在80%以上。而癌旁組織和正常相應(yīng)組織陽性率低于10%，為低水平表達(dá)?？傮w上，端粒酶表達(dá)與臨床特征無明顯關(guān)系，但與臨床病理學(xué)特征有一定。一些研究表明端粒酶活性反映了細(xì)胞的惡變程度。例如SCLC的惡性程度高于NSCLC，故端粒酶的檢出率和活性均高于NSCLC^[7]。胃癌中端粒酶陽性腫瘤惡性程度較高^[8]。前列腺癌組織中端粒酶活性相對水平與病理分化有關(guān)，高水平端粒酶活性在分化差的前列腺癌中更常見^[9]。
　　3.3 在一些前侵襲性病變中端粒酶表達(dá)水平增加，如結(jié)腸腫瘤^[10]、口腔原位癌和發(fā)育異常病灶^[1]約半數(shù)表現(xiàn)端粒酶活性，盡管前侵襲病變并非都進(jìn)展為癌，但其中端粒酶表達(dá)陽性者似乎可列為密切監(jiān)控的對象。
　　3.4 迄今為止的資料提示端粒酶可預(yù)測腦膜瘤、急性髓性白血病和胃腸道癌癥的預(yù)后。Langford等^[12]報(bào)道在端粒酶陽性的普通腦膜瘤患者中端粒酶活性與預(yù)后顯著相關(guān)，這些形態(tài)學(xué)上良性的普通腦膜瘤中端粒酶的出現(xiàn)提示其中含有一群無限增殖細(xì)胞。在急性髓性白血病，端粒酶活性水平與特定的預(yù)后差的細(xì)胞遺傳學(xué)特征（11q異常、染色體5和7缺失）相關(guān)^[13]。
　　由于端粒酶在大部分惡性腫瘤檢出率很高，有可能用作癌癥篩查的標(biāo)志物。但是以侵入性方法獲取腫瘤組織樣品十分困難，非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)傷性獲取樣品確定其端粒酶表達(dá)已受到積極關(guān)注。
　　kinoshita等^[14]比較了一組膀胱癌腫瘤樣品與隨意尿、膀胱沖洗脫落細(xì)胞的端粒酶表達(dá)。腫瘤組織樣品、膀胱沖洗液、隨意尿中端粒酶檢出率分別為98%（41/42）、84%（36/43）、55%（23/42）。而45例膀胱癌尿脫落細(xì)胞學(xué)僅42%檢出癌細(xì)胞。無癌者的膀胱沖洗液未檢出端粒酶。尿液和沖洗液脫落細(xì)胞端粒酶在I級癌檢出率為75%（9/12），II級為96%（27/28），而細(xì)胞學(xué)檢出癌細(xì)胞率I級為8%（1/12），II級為46%（13/28）。表明端粒酶檢測癌癥的敏感性顯著高于細(xì)胞學(xué)檢查，對膀胱癌的早期診斷和隨訪十分有用。
　　yoshita等^[5]對有或無結(jié)腸癌的住院患者的結(jié)腸沖洗物檢測端粒酶，其敏感性為60%（9/15），特異性為100%。在頭頸部癌患者的口腔沖洗物中，端粒酶陽性率達(dá)32%（14/42），未發(fā)現(xiàn)口腔沖洗物陽性而癌組織是陰性的現(xiàn)象^[11]。
　　作為微創(chuàng)傷性方法的細(xì)針穿刺在腫瘤的診斷取樣中被常規(guī)采用。Hiyama等^[16]在15例后來經(jīng)術(shù)后標(biāo)本組織病理學(xué)確診的乳腺癌的針吸標(biāo)本中全部檢出端粒酶表達(dá)。在有或無乳腺癌的患者中，細(xì)針抽吸樣品端粒酶檢測的診斷敏感性為67%，特異性90%^[17]。Nouso等^[18]用21G針活檢取肝癌患者肝組織，端粒酶陽性率80%（8/10），與手術(shù)標(biāo)本的端粒酶陽性率87%（20/23）無明顯差異。說明細(xì)針活組織取樣檢測端粒酶可作為癌癥早期檢出的有力手段。
　　4 端粒酶測定方法
　　端粒酶由RNA和酶蛋白組成，其活性依賴于其RNA成分，用RNA酶處理后活性大部分喪失^[1]。目前檢測端粒酶表達(dá)有二種方法：一是以測其DNA聚合酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）；二是用RT-PCR測RNA組份。一些人認(rèn)為人端粒酶RNA組份可能比酶本身更與前侵襲性侵襲性腫瘤相關(guān)，但目前組織細(xì)胞端粒酶檢測仍是采用TRAP法為主?，F(xiàn)將標(biāo)準(zhǔn)的TRAP分析步驟介紹如下^[3]：（1）用特殊緩沖液裂解待檢細(xì)胞制備出含端粒酶的抽提物；（2）用抽提物延伸引物TS（5’-AATCCGTCGAGC aGAGTT-3’）。由于端粒酶表現(xiàn)為步進(jìn)活性（progressive activity），每延伸一個TTAGGG序列便終止，進(jìn)入下一次延伸，因而產(chǎn)生了6bp差異的長度異質(zhì)產(chǎn)物。（3）端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物用引物CX（5’-CCCTTACCC tTACCCTTACCCTAA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃30″、50℃30″、72℃45″，31個周期）。此步反應(yīng)摻入α-³²P dCTP以便顯示。（4）PCR產(chǎn)物用PAG分離，放射自顯影顯示。結(jié)果出現(xiàn)RNAse敏感的6bp梯子DNA帶為端粒酶陽性。
　　附表 惡性腫瘤組織端粒酶活性

腫瘤部位或類型	正常良性組織 　　癌旁組織	腫瘤組織（%）
頭頸扁平細(xì)胞癌	0/17正常組織	54/64（84.3）
肺 癌	3/68癌旁組織	109/136 （80.1）
肝 癌	4/46無癌肝組織	22/26 （85）
胃 癌	2/34癌旁組織	58/66 （85）
賁門食管癌	0/8正常組織	9/9
胰 腺 癌	0/11良性瘤組織	41/43 （95.3）
結(jié) 腸 癌	5/35對應(yīng)正常組織	22/23 （95.6）
腎 癌	0/10正常組織	40/56 （71）
前列腺癌	0/10正常和良性增生 　　1/10癌旁良性增生	28/31 （90）
膀 胱 癌	0/17非病灶	41/42 （98）
婦科惡性腫瘤		37/39 （95）
血液腫瘤		14/16 （87）
ALL		14/16 （87）
AML		41/56 （73）
皮 膚 癌	1/10正常皮膚	91
黑色素瘤	5/17良性黑痣	15/21 （71.4）

5 結(jié) 語
　　大量的研究已證實(shí)惡性腫瘤組織細(xì)胞中端粒酶活性增高與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，檢測端粒酶活性用于惡性腫瘤早期診斷顯示出誘人的前景。但有關(guān)端粒酶與腫瘤發(fā)生的過程有許多問題尚待闡明，如端粒酶是怎樣激活的？同一種腫瘤為何有的表達(dá)有的則不表達(dá)端粒酶？無端粒酶表達(dá)的細(xì)胞是如何逃避衰老而成為無限增殖細(xì)胞？端粒酶、端粒酶RNA二者究竟誰zui能真實(shí)反映端粒酶在腫瘤中的表達(dá)？端粒酶分析方法尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化等。
　　今后，應(yīng)在常見惡性腫瘤中進(jìn)一步研究何種腫瘤是端粒酶診斷應(yīng)用的*靶腫瘤，進(jìn)行檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，發(fā)展端粒酶定量檢測和原位檢測方法，研究端粒酶表達(dá)在癌癥監(jiān)測、療效和預(yù)后判斷中的作用。
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